Excel计算RSD值(excel计算rsd)

比对的控制（二）

在比对的控制（一）中，主要介绍了硬件比对，这一篇主要介绍软件比对，例如人员、方法方面的比对，除此之外会包括一些硬件的比对，比如仪器比对。

比对实验主要体现的就是批内、批间的精密度。

涉及到人员、方法、仪器的时候就大概包括：

a.相同时间、相同条件、多次测量比对；

b.相同时间、不同条件、多次测量对比；

c.不同时间、相同条件、多次测量比对；

d.不同时间、不同条件、多次测量比对。

具体产生的项目有：人员比对、仪器比对、方法比对、留样复测、基质效应等；

体现的名词是：重复性、再现性；

体现的数据多为：精密度[实验室变异系数(CV)或相对标准偏差(RSD)]、t、f等；

使用到的技术：合成RSD、T检验、F检验等。

鉴于：标准曲线的剩余标准偏差、判定系数的计算和方差齐性检验中对F检验已经有所描述，因此本篇不再重复。

基于以上“abcd”四条所述，可以归纳出，本篇所述比对，有两点需要满足：

a.尽量少的变量：应尽量少的减少变量，如果变量为单则最好，比对出来的结论更加显著体现某一方面，例如：两位不同的人员使用同一套检测流程和检测仪器，进行同一个试样的多份数同步检测。这就是人员比对了，比较的是人员的操作水平。

b.唯一要保证的是同步的多次测量，目的是消除随机误差，防止比对实验因为单次测量的随机误差产生谬误结论。

那么几次平行测定才符合要求呢？给出两个不成熟的建议：

a.可以看到，RSD在5-11次的时候，趋于平稳，那么可以选择7-9次平行测定，本结论数据为模拟，不具有实际指导意义。

b.基于以上思路，可以使用正态分布模拟测定次数，计算RSD作图。

可以看到模拟100次数据后，能稳定在1SD范围内，是在21次平行开始的。

Excel模拟数据的公式如下：

b1.计算实际数据的平均值：=ERAGE(N2:N12)；

b2.计算实际数据标准偏差：=STDEV.S(N2:N12)；

b3.模拟公式：=ROUND(NORM.INV(RAND(),平均值,标准偏差),LEN(RIGHT(某一个实际数值,LEN(某一个实际数值)-FIND(".",某一个实际数值))))

公式由两部分组成：

ROUND部分可以不用，即公式简化为：NORM.INV(RAND(),平均值,标准偏差)。

建议使用a.提及的方式，使用实际数据，并且再次提醒，所有数据皆为“拍脑袋”想出来的，完全不具有实际指导意义。

RSD和合成RSD：

RSD可以用于双人对照，合成RSD可以用于双组对照。

合成RSD公式如下：

如果需要做重现性，将RSD换成SD即可，因为GB/T 27404中是使用SD计算重现性的。

为了方便，上一篇中引用的GB/T 27417中的变异系数的要求再次贴上。

并引用GB/T 27417中重复性、重现性自由度对照表。

高效液相色谱法测，含量及其多元统计分析如何？

白芷是一味中医临床常用传统中药材，为伞形科植物白芷Angelica dahurica(Fisch. ex Hoffm.) Benth. et Hook. F或杭白芷A. dahurica(Fisch. ex Hoffm.) Benth. et Hook. F. var. formosana(Boiss.) Shan et Yuan 的干燥根，始载于《神农本草经》,其性温，气芳香，味辛，微苦，具有散风除湿、通窍止痛作用，临床多用于治疗感冒头痛、眉棱骨痛、鼻渊等。

白芷中含有香豆素类、挥发油类、多糖类、生物碱类等多种化学成分。现代药理学研究表明香豆素类化学成分具有多种药理活性，如镇痛、消炎、抗氧化、抗肿瘤和抗高血压等。

不同产地及不同加工方式对白芷质量均有所影响。并且导致有害物质(如二氧化硫)残留。目前，针对白芷的化学成分的研究报道广泛，但系统评价白芷质量的报道较少，如何全面、系统、有效地评价白芷的质量仍然备受中医药研究者关注。

本工作采用高效液相色谱法(HPLC)同时测定白芷药材中欧前胡素、异欧前胡素、补骨脂素、水合氧化前胡素、佛手苷内酯、白当归脑、花椒毒酚、氧化前胡素、白当归素等9种香豆素类化学成分的含量，并利用SPSS 26软件和SIMCA 14.1软件，结合聚类分析(CA)、主成分分析(PCA)、正交偏最小二乘法-判别分析(OPLS-DA)等多元统计学方法对所测香豆素类化学成分进行综合分析，为更全面、系统地评价白芷药材质量提供科学依据。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

Waters AcQuity Arc型高效液相色谱仪。

混合对照品储备溶液：称取适量的9种香豆素类化学成分对照品，用甲醇溶解并配制成欧前胡素质量浓度为130 mg·L-1,佛手苷内酯质量浓度为130 mg·L-1,白当归素质量浓度为130 mg·L-1的混合对照品储备溶液，于4 ℃储存备用。

欧前胡素(110826-201918)、异欧前胡素(110827-201812)、补骨脂素(110739-201918)、水合氧化前胡素(B21189)、佛手苷内酯(B20395)、白当归脑(B20026)、花椒毒酚(B20537)、氧化前胡素(B21471)、白当归素(P01028SA13);30批白芷药材由某公司提供，经鉴定均为白芷Angelica dahurica的干燥根，样品信息见表1。

表1 白芷药材样品信息 导出到EXCEL

Tab. 1 Information for Angelica dahurica samples

窗体顶端

窗体底端

1.2 色谱条件

CAPCELLPAK C18 MGⅡ色谱柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm);流量1.0 mL·min-1;进样量20 μL;检测波长254 nm; 流动相A为水，B为乙腈。梯度洗脱程序：0～16 min时，A由90%降至55%;16～30 min时，A由55%降至43%;30～40 min时，A由43%降至37%,保持5 min。

1.3 试验方法

将白芷药材晾干，反复粉碎后，精密称取白芷药材粉末[过65目筛，孔径为(250±9.9)μm] 0.2 g, 加入甲醇20 mL,按照《中华人民共和国药典》(2020年版)一部白芷药材含量测定方法进行处理，所得溶液按照色谱条件进行测定。

2 结果与讨论

2.1 色谱行为

按照色谱条件测定混合对照品溶液和白芷样品溶液，所得色谱图见图1。

图1 混合对照品溶液和白芷样品溶液的色谱图 下载原图

Fig.1 Chromatograms of mixed standard solution and Angelica dahurica sample solution

1-花椒毒酚；2-水合氧化前胡素；3-白当归素；4-补骨脂素；5-佛手苷内酯；6-白当归脑；7-氧化前胡素；8-欧前胡素；9-异欧前胡素

2.2 标准曲线与检出限

将混合对照品储备溶液用甲醇逐级稀释配制成混合对照品溶液系列，按照色谱条件测定。以目标物的质量浓度为横坐标，对应的峰面积为纵坐标绘制标准曲线。以3倍信噪比(S/N)对应的目标物的质量浓度作为检出限(3S/N),结果见表2。

表2 线性参数和检出限 导出到EXCEL

Tab. 2 Linearity parameters and detection limits

窗体顶端

窗体底端

2.3 精密度和稳定性试验

将花椒毒酚质量浓度为4.8 mg·L-1、水合氧化前胡素质量浓度为2.8 mg·L-1、白当归素质量浓度为2.6 mg·L-1、补骨脂素质量浓度为0.8 mg·L-1、佛手苷内酯质量浓度为2.6 mg·L-1、白当归脑质量浓度为2.8 mg·L-1、氧化前胡素质量浓度为3.2 mg·L-1、欧前胡素质量浓度为2.6 mg·L-1和异欧前胡素质量浓度为1.2 mg·L-1的混合对照品溶液连续测定6次，计算9种化学成分的色谱峰面积的相对标准偏差(RSD),考查仪器的精密度，结果见表3。

精密称取样品S1粉末0.2 g, 按1.3节试验方法平行制备6份样品溶液，进行重复性试验，计算9种化学成分色谱峰面积的RSD,结果见表3。

精密称取样品S1粉末0.2 g, 按1.3节试验方法制备样品溶液，放置0,2,4,8,12,24,48 h后测定样品溶液中9种化学成分的含量，计算9种化学成分色谱峰面积的RSD,考查样品溶液的稳定性，结果见表3。

由表3可知：混合对照品溶液中9种化学成分的色谱峰面积的RSD为0.70%～1.8%,表明仪器精密度良好；6份样品溶液中9种化学成分的色谱峰面积的RSD为1.2%～2.4%,说明重复性较好；48 h内样品溶液中9种化学成分的色谱峰面积的RSD为0.70%～2.2%,表明样品溶液在48 h内稳定性较好。

2.4 回收试验

精密称取样品S1粉末0.1 g, 平行6份，进行样品加标试验，计算每种化学成分的回收率和测定值的RSD,结果见表4。

表3 精密度和稳定性试验结果 导出到EXCEL

Tab. 3 Results of tests for precision and stability

窗体顶端

窗体底端

表4 回收试验结果(n=6) 导出到EXCEL

Tab. 4 Results of test for recovery(n=6)

窗体顶端

窗体底端

由表4可知，9种化学成分的回收率为99.1%～106%,测定值的RSD为1.2%～2.5%,说明该方法的准确度较好，可用于白芷中9种香豆素类化学成分含量的测定。

2.5 样品分析

将产自四川、安徽、河北、河南的30批白芷药材样品按照1.3节试验方法制备成样品溶液，按照色谱条件测定，计算9种化学成分在白芷药材中的含量(以干燥品计算),结果见图2。

结果表明，欧前胡素的平均含量最高(质量分数1 527 μg·g-1),其次为氧化前胡素(质量分数897 μg·g-1),补骨脂素的平均含量最低(质量分数21 μg·g-1)。

利用SPSS 26软件对未硫熏样品和硫熏样品中9种化学成分的含量分别进行显著性差异分析，结果如图3所示，“*”代表有显著性差异(P<0.05)。

图2 30批白芷药材样品中9种化学成分的测定值 下载原图

Fig. 2 Determined values of 9 chemical components in 30 batches of Angelica dahurica samples

图3 硫熏对白芷药材样品中9种化学成分含量的影响 下载原图

Fig. 3 Effect of sulphur fumigation on the contents of 9 chemical components in Angelica dahurica samples

(g) 氧化前胡素 (h) 欧前胡素 (i) 异欧前胡素

结果显示：未硫熏样品和硫熏样品中除花椒毒酚和补骨脂素含量无显著性差异(P>0.05),其余香豆素类化学成分含量均差异显著(P<0.05)。未硫熏样品中欧前胡素的质量分数为1 161.2～2 794.7 μg·g-1,氧化前胡素的质量分数为706.8～2 010.8 μg·g-1,异欧前胡素的质量分数为576.3～1 003.7 μg·g-1;硫熏样品中欧前胡素的质量分数为236.6～893.0 μg·g-1,氧化前胡素的质量分数为0.3～2.9 μg·g-1,异欧前胡素的质量分数为258.8～540.6 μg·g-1,硫熏样品中氧化前胡素、异欧前胡素、欧前胡素等的含量显著低于未硫熏样品。上述统计结果表明硫熏的加工方法对白芷中香豆素类化学成分有显著影响。

由于不同批次药材样品中9种香豆素类化学成分含量均有不同程度的差异，为进一步分析不同批次白芷的质量，以每批样品中所测9种香豆素类化学成分含量的总和作为总香豆素含量，从图4中可看出未硫熏样品总香豆素含量明显高于硫熏样品，进一步证明硫熏对白芷质量有较大影响。

图4 30批白芷药材样品中总香豆素含量 下载原图

Fig. 4 Contents of total coumarins in 30 batches of Angelica dahurica samples

2.6 多元统计分析

2.6.1 聚类分析

将所测30批白芷中9种香豆素类化学成分的含量利用SIMCA 14.1软件进行CA,结果见图5。

由图5可知：各批次白芷样品主要分为3类，所有硫熏样品(S19～S30)聚为一类；产地为河南、河北的7批未硫熏样品聚为一类，样品编号为S1,S6,S9,S10,S12,S15和S18;产地为四川、安徽的11批未硫熏样品聚为一类，样品编号为S2～S5,S7,S8,S11,S13,S14,S16,S17。

图5 30批白芷药材样品的CA结果 下载原图

Fig. 5 Results of CA in 30 batches of Angelica dahurica samples

2.6.2 主成分分析

利用SIMCA 14.1软件对30批白芷药材中9种化学成分的含量进行PCA,共提取出2个主成分，其累积方差贡献率为89.3%,包含了白芷药材的大部分信息。从图6中可以看出氧化前胡素、欧前胡素距离载荷图原点较远，表明氧化前胡素、欧前胡素对主成分的贡献较大，对白芷药材的整体质量起主要作用。进一步以主成分1和2得分做30批白芷药材的PCA得分图，图7表明PCA结果与CA结果基本一致，所有硫熏样品聚为一类，产地为河南、河北的未硫熏样品聚为一类，产地为四川、安徽的未硫熏样品聚为一类。

图6 30批白芷药材样品的主成分载荷图 下载原图

Fig. 6 Loading plot of principal components in 30 batches of Angelica dahurica samples

图7 30批白芷药材样品的PCA散点得分图 下载原图

Fig. 7 PCA scatter plot of 30 batches of Angelica dahurica samples

2.6.3 正交偏最小二乘法-判别分析

为进一步分析不同类别白芷样品之间的差异，依据CA和PCA结果，采用SIMCA 14.1软件对30批白芷药材样品进行有监督的OPLS-DA建模分析，散点得分图见图8,同CA和PCA分析结果基本一致，分为3类。该模型x轴方向的累积解释率RX2和y轴方向的累积解释率RY2分别为0.787和0.765,累计预测率Q2为0.674,均大于0.5,表明本试验所建立的模型成立[19],可用于白芷药材的质量控制。为进一步确定对白芷药材质量贡献较大的成分。

利用变量重要性投影值(VIP)筛选，结果表明氧化前胡素、欧前胡素(VIP>1.0)色谱峰对整体模型的贡献度高于平均水平，结果见图9。这2个化合物是各批次白芷药材产生差异的主要指标性成分，该结果与PCA中载荷图寻找的对主成分贡献较大的成分结果一致，表明氧化前胡素和欧前胡素的含量变化与白芷的质量密切相关。单一指标性成分的含量测定无法满足白芷质量评价，应当同时关注氧化前胡素和欧前胡素的含量变化。

图8 30批白芷药材样品的OPLS-DA散点得分图 下载原图

Fig. 8 OPLS-DA scatter plot of 30 batches of Angelica dahurica samples

图9 30批次白芷药材样品中各化学成分的VIP 下载原图

Fig. 9 VIP plot of chemical components in 30 batches of Angelica dahurica samples

本工作采用HPLC对30批白芷药材中9种香豆素类化学成分进行测定，并结合CA、PCA、OPLS-DA等分析手段，对白芷药材质量进行了较为全面、系统、整体地分析，筛选出了与白芷质量有关的指标性成分氧化前胡素和欧前胡素。这不仅为白芷药材的质量评价提供了依据，也为中药材质量控制指标性成分的选择提供了一种思路和方法。

比对的控制（二）

在比对的控制（一）中，主要介绍了硬件比对，这一篇主要介绍软件比对，例如人员、方法方面的比对，除此之外会包括一些硬件的比对，比如仪器比对。

比对实验主要体现的就是批内、批间的精密度。

涉及到人员、方法、仪器的时候就大概包括：

a.相同时间、相同条件、多次测量比对；

b.相同时间、不同条件、多次测量对比；

c.不同时间、相同条件、多次测量比对；

d.不同时间、不同条件、多次测量比对。

具体产生的项目有：人员比对、仪器比对、方法比对、留样复测、基质效应等；

体现的名词是：重复性、再现性；

体现的数据多为：精密度[实验室变异系数(CV)或相对标准偏差(RSD)]、t、f等；

使用到的技术：合成RSD、T检验、F检验等。

鉴于：标准曲线的剩余标准偏差、判定系数的计算和方差齐性检验中对F检验已经有所描述，因此本篇不再重复。

基于以上“abcd”四条所述，可以归纳出，本篇所述比对，有两点需要满足：

a.尽量少的变量：应尽量少的减少变量，如果变量为单则最好，比对出来的结论更加显著体现某一方面，例如：两位不同的人员使用同一套检测流程和检测仪器，进行同一个试样的多份数同步检测。这就是人员比对了，比较的是人员的操作水平。

b.唯一要保证的是同步的多次测量，目的是消除随机误差，防止比对实验因为单次测量的随机误差产生谬误结论。

那么几次平行测定才符合要求呢？给出两个不成熟的建议：

a.可以看到，RSD在5-11次的时候，趋于平稳，那么可以选择7-9次平行测定，本结论数据为模拟，不具有实际指导意义。

b.基于以上思路，可以使用正态分布模拟测定次数，计算RSD作图。

可以看到模拟100次数据后，能稳定在1SD范围内，是在21次平行开始的。

Excel模拟数据的公式如下：

b1.计算实际数据的平均值：=ERAGE(N2:N12)；

b2.计算实际数据标准偏差：=STDEV.S(N2:N12)；

b3.模拟公式：=ROUND(NORM.INV(RAND(),平均值,标准偏差),LEN(RIGHT(某一个实际数值,LEN(某一个实际数值)-FIND(".",某一个实际数值))))

公式由两部分组成：

ROUND部分可以不用，即公式简化为：NORM.INV(RAND(),平均值,标准偏差)。

建议使用a.提及的方式，使用实际数据，并且再次提醒，所有数据皆为“拍脑袋”想出来的，完全不具有实际指导意义。

RSD和合成RSD：

RSD可以用于双人对照，合成RSD可以用于双组对照。

合成RSD公式如下：

如果需要做重现性，将RSD换成SD即可，因为GB/T 27404中是使用SD计算重现性的。

为了方便，上一篇中引用的GB/T 27417中的变异系数的要求再次贴上。

并引用GB/T 27417中重复性、重现性自由度对照表。